Bác Sĩ Của Bạn

Chương 2

Phương pháp nghiên cứu enzyme

Có hai loại phương pháp dùng để nghiên cứu các phản ứng

enzyme. Một trong hai phương pháp đó là lựa chọn các mẫu sau những

thời gian nhất định và đo sự biến đổi của phản ứng enzyme. Qua hàng loạt

điểm riêng biệt nhận được sẽ xây dựng được đường biểu diễn của các

bước phản ứng. Phương pháp khác là tiến hành quan sát bản thân hỗn hợp

phản ứng theo tiến tr.nh xảy ra và có thể xây dựng được một số lớn

những thay đổi, hoặc dựa vào các phương pháp tự động để ghi lại.

Chúng ta sẽ nhận được những đường biểu diễn liên tục các bước phát

triển của phản ứng enzyme.

Ở phương pháp đầu, người ta thường đo nồng độ cơ chất hoặc

nồng độ sản phẩm của phản ứng. Nếu phản ứng tăng thi cả hai cách vừa

nêu ở trên có thể được sử dụng để đo hoạt động của enzyme.

Trong mỗi trường hợp xác định tốc độ, người ta phải nhận được ít

nhất là 3 điểm: một điểm ở thời điểm không, điểm thứ hai ở khoảng thời

gian nhất định đ. trôi qua, điểm thứ 3 ở khoảng thời gian lớn gấp hai lần

khoảng trước. Từ đó có thể kiểm tra được sự đúng đắn của phản ứng

enzyme trong khoảng thời gian quan sát.

Nói chung, phần lớn các phương pháp được sử dụng để nghiên cứu

các phản ứng enzyme là loại phương pháp nghiên cứu liên tục v. nó được

mọi người ưa dùng hơn.

2.1. Những nguyên tắc chung khi nghiên cứu enzyme

Như phần đầu đ. nói đến, enzyme là những chất xúc tác sinh học

có bản chất protein và rất không ổn định. Trong những điều kiện bất lợi,

chúng rất không bền, có thể dễ dàng bị biến tính (denaturation) và bị mất

hoạt độ. Do đó, khi làm việc với enzyme, phải luôn luôn chú . tránh

những điều kiện dễ làm mất hoạt độ của nó. Thông thường phần lớn các

enzyme hoạt động được ở vùng pH trung tính hoặc gần như trung

tính (pH = 7 ± 2). V. vậy các yếu tố acid mạnh, kiềm mạnh dễ gây

biến tính enzyme.

Những ion kim loại nặng như ch., đồng, thủy ngân... và các điều

kiện về nhiệt độ cao cũng thường làm mất hoạt độ enzyme. Đặc biệt là khi

tách và làm sạch enzyme, cần tiến hành ở nhiệt độ thấp. Nhiệt độ thường

dùng cho các công việc này thông thường từ 00C đến 50C. Đối với các

enzyme không bền, các công đoạn làm sạch có thể được tiến hành ở nhiệt

độ thấp hơn (từ - 50C đến - 200C). Trong các trường hợp này, người ta hay

sử dụng các hỗn hợp lạnh như nước đá với CO2 hoặc nước đá với muối

NaCl, hoặc thậm chí người ta dùng cả hỗn hợp nước đá với sulfuric acid

đậm đặc... Ví dụ về một số hỗn hợp làm lạnh đ. được tr.nh bày trên bảng 2.1.

Bảng 2.1. Hỗn hợp làm lạnh

Thành phần hỗn hợp Tỷ lệ Nhiệt độ đạt được

Nước đá: muối 100:33 (3:1) - 21,30C

Nước đá: H2SO4 đậm đặc 100: 25 (4:1) - 20,00C

Như trên đ. nói, nhiều enzyme bị mất hoạt tính ở các dung dịch có

pH < 5 hoặc pH > 9, tuy rằng có một số ngoại lệ như pepsin bền trong

acid. Do đó, tùy thuộc mỗi loại enzyme, song nên chú . tránh pH quá acid

hoặc quá kiềm. Khi điều chỉnh pH của dung dịch đệm có chứa enzyme cần

phải thêm từ từ và rất thận trọng các acid hoặc kiềm. Và khi thêm hóa chất

để điều chỉnh pH th. nên tiến hành ở 00C. Khi làm việc với enzyme cũng

cần chú . tránh tạo bọt v. nhiều enzyme bị biến tính (mất hoạt tính) ở mặt

phân cách hai pha nước và khí. Để tránh việc tạo bọt có thể xảy ra, người

ta thường rót dung dịch enzyme theo thành ống thủy tinh và không được

lắc. Có khi việc tách từng phần enzyme bằng bột dễ làm mất hoạt tính

enzyme. V. vậy, để khắc phục t.nh trạng này, người ta thường thêm

ammonium sulfate dưới dạng dung dịch b.o h.a của nó.

Trong khi xử l. các mẫu thí nghiệm như cắt, thái, xay nhỏ các

mẫu thực vật và động vật (ví dụ lá cây, thịt, các cơ quan nội tạng...) không

dùng các dụng cụ dao kéo dụng cụ xay đ. han rỉ để tránh tác dụng của các

ion kim loại nặng như (Cu, Pb, Fe...) mà dùng dụng cụ inox..

Khi dùng các dung môi hữu cơ như aceton, alcol để kết tủa

enzyme cần tiến hành ở nhiệt độ thấp. Tách kết tủa enzyme bằng cách ly

tâm lạnh tốt hơn lọc lạnh v. tiến hành nhanh hơn. Ở một số trường hợp,

khi tách và làm sạch enzyme có hiện tượng giảm dần hoạt độ, v. vậy cần

phải làm thí nghiệm nhanh. Tốt nhất là thực hiện thí nghiệm liên tục,

không ngắt quảng. Ví dụ tách chiết các enzyme chống oxy hóa

(antioxidant enzyme) ở ty thể trong v.ng 6h và đo luôn nếu không th. mất

hoạt tính. C.n ở microsome th. tiến tr.nh có thể kéo dài hơn vẫn

không ảnh hưởng đến hoạt độ các enzyme chống oxy hóa và các

enzyme oxy hóa khử.

Một điều cần chú . nữa là trong khi tiến hành xác định hoạt độ của

các enzyme, nếu đ. xác định trong khoảng nhiệt độ nào th. tất cả các thành

phần của hỗn hợp phản ứng phải được giữ ở nhiệt độ ấy. Lúc này nhất

thiết phải dùng máy ổn nhiệt ( thermostate). Khi hỗn hợp phản ứng đ. đạt

được nhiệt độ cần thiết th. mới tiến hành đo. pH trong quá tr.nh này cũng

phải được giữ ổn định bằng dung dịch đệm và phải đảm bảo độ chính xác

của pH: những phản ứng tạo acid th. phải thêm kiềm vào và ngược lại. Để

đảm bảo kết quả tin cậy, tránh sai số nhiều, phải lấy thật chính xác lượng

dịch enzyme. Người ta thường dùng loại pipette không chia độ hoặc sau

này dùng các loại micropipette. Trong khi thí nghiệm cần chú . tránh đánh

rơi enzyme vào dung dịch nghiên cứu. Ví dụ đang làm thí nghiệm với

amylase chẳng hạn th. không nói chuyện nhiều. Khi đ. có chế phẩm

enzyme, cần bảo quản chúng ở nhiệt độ thấp. Một số enzyme ổn định ở

dung dịch đậm đặc của ammonium sulfate. Trong trường hợp này, người

ta giữ các kết tủa ở dạng huyền phù trong dung dịch ammoni sulphate b.o

h.a và lấy chế phẩm ra bằng cách ly tâm. Trong điều kiện ph.ng thí

nghiệm, việc sấy khô chế phẩm enzyme sẽ làm mất hoạt độ enzyme hoàn

toàn. Nhưng ở điều kiện chân không nếu sấy khô ở nhiệt độ thấp hoặc

dùng phương pháp đông khô (lyophilization) th. có thể duy tr. được hoạt

động b.nh thường của chúng.

2.2. Tách và làm sạch (tinh chế) enzyme

2.2.1. Chọn nguồn nguyên liệu

Enzyme là những chất xúc tác sinh học, có nhiều trong cơ thể

sống. Việc điều chế chúng bằng phương pháp hóa học với số lượng lớn là

việc làm rất khó khăn và đầy tốn kém nếu không muốn nói là điều không

tưởng, nên người ta thường thu nhận chúng từ các nguồn sinh học. Mặc dù

enzyme có trong tất cả các cơ quan, mô của động vật thực vật cũng như

trong tế bào vi sinh vật, song việc tách enzyme đáp ứng yêu cầu về mặt

kinh tế chỉ có thể tiến hành khi nguyên liệu có chứa một lượng lớn enzyme

cũng như cho phép thu được enzyme với hiệu suất cao và dễ dàng tinh chế

chúng. Việc phân bố của enzyme trong tế bào cũng không đồng đều, trong

một loại tế bào cũng có thể có nhiều enzyme này song không có enzyme

khác. Lượng enzyme lại thay đổi tùy theo giai đoạn sinh trưởng phát triển

của sinh vật và tùy theo loài nên chúng ta phải chọn nguồn nguyên liệu

thích hợp cho việc chiết rút và tinh chế enzyme. Có ba nguồn nguyên liệu

sinh học cơ bản: các mô và cơ quan động vật, mô và cơ quan thực vật, tế

bào vi sinh vật.

Trong tất cả các nguyên liệu có nguồn gốc động vật th. tuyến tuỵ,

màng nhầy dạ dày, tim... dùng để tách enzyme rất thuận lợi. Dịch tuỵ tạng

có chứa amylase, lipase, protease, ribonuclease và một số enzyme khác.

Từ ngăn tư của dạ dày bê nghé người ta có thể thu nhận chế phẩm

renin để làm đông sữa trong sản xuất fomat. Người ta cũng sản xuất

pepsin từ dạ dày động vật. Nhưng khác với pepsin, renin có khả năng đông

tụ sữa cao mà không thủy phân sâu sắc casein. Renin là chế phẩm enzyme

có giá trị lớn trong công nghiệp.

Ở thực vật: thông thường enzyme hay có mặt ở các cơ quan dự trữ

như hạt, củ, quả. Cơ quan dự trữ giàu chất g. th. nhiều enzyme chuyển hóa

chất ấy. Ví dụ trong hạt cây thầu dầu có nhiều lipase, trong hạt đậu tương

có nhiều enzyme urease.

Thóc nảy mầm chứa nhiều a - amylase, ở củ khoai lang lại có

nhiều b - amylase. Người ta đ. thu được một số chế phẩm enzyme thủy

phân như papain, bromelain, fixin từ thực vật bậc cao. Papain thu được từ

mẫu nhựa đu đủ xanh, bromelain thu được từ các bộ phận (lá, thân, quả)

cây dứa, c.n fixin được tách từ dịch ép thân và lá cây Ficus.

Qua các nguồn nguyên liệu động, thực vật chính có thể từ đó chiết

xuất các chế phẩm enzyme, chúng ta thấy rằng hai nguồn nguyên liệu này

không thể dùng để sản xuất các chế phẩm enzyme với quy mô lớn bởi các

nhược điểm sau đây:

- Chu kỳ sinh trưởng của chúng dài

- Nguồn nguyên liệu này không cải tạo được.

- Nhiều nguyên liệu dùng làm thực phẩm (dùng để ăn) không thể

dùng làm nguyên liệu để sản xuất với quy mô lớn các chế phẩm enzyme

nhằm thoả m.n các nhu cầu của nền kinh tế quốc dân. Dùng vi sinh vật

làm nguồn nguyên liệu để sản xuất các chế phẩm enzyme có nhiều ưu

điểm nổi bật và có tính chất độc đáo vượt xa so với nguồn nguyên liệu

từ động vật, thực vật, cũng như sẽ khắc phục được mọi khó khăn và

hạn chế ở trên.

Trước hết vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất

enzyme với số lượng lớn. Đây cũng là nguồn nguyên liệu mà con người

chủ động tạo ra được. Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn (từ 16 - 100

giờ) v. vậy có thể nuôi cấy hàng trăm lần trong năm.

Enzyme vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vượt xa các sinh vật

khác. V. vậy chỉ cần một lượng nhỏ enzyme có thể chuyển hóa một lượng

lớn cơ chất. Số liệu tính toán cho biết, trong v.ng 24 giờ, vi sinh vật có

khả năng chuyển hóa một lượng thức ăn gấp 30 - 40 lần so với trọng lượng

cơ thể chúng. Trong khi đó, hệ enzyme của con lợn trên 50 kg chỉ có thể

chuyển hóa được vài kg thức ăn trong ngày.

Hệ enzyme vi sinh vật vô cùng phong phú. Vi sinh vật có khả năng

tổng hợp nhiều loại enzyme khác nhau, trong đó có những enzyme ở động,

thực vật không tổng hợp được. Ví dụ cellulase, raxemase...Phần lớn các

thức ăn để nuôi vi sinh vật lại dễ kiếm và giá rẻ. Nhiều vi sinh vật cho

enzyme thường có khả năng phát triển trên các môi trường đơn giản, giá

rẻ, dễ kiếm như các phế liệu của các ngành sản xuất. Hơn nữa, có thể dùng

những nguyên liệu không phải thực phẩm, những dung dịch muối vô cơ để

nuôi vi sinh vật. V. vậy dùng vi sinh vật làm nguồn thu enzyme sẽ mang

lại giá thành rẻ, thời gian nhanh và hiệu quả kinh tế cao.

Vi sinh vật sinh sản phát triển với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, khối

lượng lại nhỏ, kích thước bé, nhưng tỷ lệ enzyme trong tế bào tương đối

lớn nên quy tr.nh sản xuất chế phẩm enzyme khá dễ dàng, hiệu suất thu

hồi cao. Lượng enzyme có thể được sản xuất ra trong một thời gian ngắn.

Đối với một số trường hợp có thể dùng 100% sinh khối vi sinh vật làm

nguồn enzyme.

Vi sinh vật rất nhạy cảm đối với tác động của môi trường, thành

phần dinh dưỡng nuôi chúng cũng như một số tác nhân l. hóa, cơ học

khác. Do đó có thể thay đổi những điều kiện nuôi cấy để chọn giống tạo

những chủng đột biến cho ta hàm lượng enzyme đáng kể với hoạt tính xúc

tác cao. Có thể nói rằng, nhờ nguồn enzyme vi sinh vật, người ta có thể

điều khiển sự tổng hợp enzyme dễ dàng hơn các nguồn nguyên liệu khác

để tăng lượng enzyme được tổng hợp hoặc tổng hợp định hướng enzyme.

Tuy vậy trong quá tr.nh chọn nguồn nguyên liệu từ vi sinh vật, cần lưu .

một số vi sinh vật có khả năng sinh độc tố để có biện pháp xử l. thích hợp.

Nói chung các vi sinh vật muốn được sử dụng làm nguồn nguyên liệu tách

enzyme cần phải thoả m.n các điều kiện sau:

- Khả năng tổng hợp enzyme mạnh trong một thời gian ngắn.

- Dễ tách enzyme và không sinh độc tố.

Có một điều lí thú là: trong điều kiện b.nh thường, vi sinh vật chỉ

tổng hợp ra một lượng enzyme vừa đủ cho hoạt động sinh l. cơ thể của

chúng ( thường được gọi là sự tổng hợp enzyme "bản thể"). Nếu khi tăng

hàm lượng một số chất hoặc thêm một số chất mới vào môi trường nuôi

cấy, đặc biệt là cơ chất của enzyme, th. sự tổng hợp enzyme tương ứng

tăng lên một cách đáng kể, khác thường có khi c.n tổng hợp enzyme mới:

hiện tượng trên gọi là sự cảm ứng sinh tổng hợp enzyme. Chất gây nên sự

cảm ứng sinh tổng hợp gọi là chất cảm ứng. Sự tổng hợp một lượng đáng

kể enzyme gọi là siêu tổng hợp enzyme.

Để thu được nguồn enzyme dồi dào từ vi sinh vật, cần phải nuôi

cấy chúng. Có hai phương pháp nuôi cấy vi sinh vật để thu enzyme:

phương pháp nuôi cấy bề mặt và phương pháp nuôi cấy bề sâu hay là

phương pháp nổi và phương pháp ch.m.

Trong phương pháp nuôi cấy bề mặt, người ta cho vi sinh vật phát

triển và bao phủ trên bề mặt các hoạt chất dinh dưỡng rắn, đ. được làm

ẩm, dùng làm môi trường (cám gạo, cám nếp, cám m., bắp xay nhỏ...). Để

môi trường xốp người ta trộn thêm một lượng nhỏ mạt cưa... Sau khi nuôi

đủ thời gian để vi sinh vật tổng hợp enzyme môi trường được sấy nhẹ,

nghiền nhỏ. Chế phẩm thu được ở dạng rắn - thô. Muốn có chế phẩm tinh

khiết phải qua giai đoạn tách và tinh chế enzyme.

Khác với phương pháp nuôi cấy bề mặt, trong phương pháp nuôi

cấy bề sâu người ta cho vi sinh vật phát triển trong môi trường lỏng.

Nguyên liệu chính và phổ biến là dịch đường glucose, fructose, maltose,

saccharose... dịch thủy phân cellulose, tinh bột... Nguồn nitơ hữu cơ

thường dùng là nước chiết bắp, chiết malt, dịch tự phân nấm men. Cần

chọn pH phù hợp với chủng vi sinh vật và sự tổng hợp enzyme theo mong

muốn. Sau khi nuôi, ta thu được canh trường lỏng - dạng thô.

Để làm tăng lượng enzyme ở vi sinh vật chúng ta cần chú . tuyển

lựa và chọn giống các chủng vi sinh vật có hoạt tính enzyme cao, tổng hợp

được enzyme cần thiết và với số lượng nhiều. Các chủng được phân lập

theo phương pháp thông thường chỉ tổng hợp một lượng nhỏ enzyme

(enzyme bản thể), do đó cần tiến hành gây đột biến bằng các phương pháp

sinh học, l., hóa học... để tạo chủng có khả năng siêu tổng hợp enzyme. Vi

sinh vật sau khi được tuyển chọn, cần được nhân giống và nuôi trong điều

kiện tối ưu để chúng sinh trưởng tốt, tổng hợp nhiều enzyme.

Ngoài ra cần phải chọn môi trường v. thành phần môi trường dinh

dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của

vi sinh vật. Trong thành phần môi trường phải có đủ các chất đảm bảo

được sự sinh trưởng b.nh thường của vi sinh vật và tổng hợp enzyme.

Đặc biệt lưu . là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa

vào hiện tượng cảm ứng. V. nếu như trong thành phần môi trường có các

chất cảm ứng th. chất đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ k.m h.m hoặc

làm yếu tác dụng k.m toả của chất k.m h.m nhằm bảo đảm khả năng sinh

tổng hợp enzyme đ. cho không bị cản trở. Chất cảm ứng tổng hợp enzyme

cho thêm vào môi trường nuôi thường là cơ chất tương ứng của enzyme

cần tổng hợp.

Ví dụ: Muốn tách a - amylase ở nấm mốc (Asp. Oryzae), người ta

cho vào môi trường nuôi cấy tinh bột, maltose, isomaltose,

oligosaccharid... có chứa liên kết a - 1,6 glucozid. Muốn tách pectinase ở

Asp. Niger, người ta cho thêm vào môi trường pectin. Đối với

hemicellulase th. chất cảm ứng là hemicellulose; c.n đối với proteinase

chất cảm ứng có hiệu lực là protein, bột đậu nành, lông, sừng nghiền nhỏ

(ở Actinomyces fradiae). Chất cảm ứng cũng có thể là những chất giống

cơ chất và những sản phẩm thủy phân của chúng. Ví dụ: thay cho protein

th. peptid và thay cho tinh bột th. erithrodextrin đều có tác dụng cảm ứng.

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đối với môi trường nuôi cấy. Nhiệt độ

nuôi cấy thông thường từ 25 - 300C. Trị số pH ban đầu của môi trường

(chủ yếu ở môi trường nước) cũng có thể gây ảnh hưởng nào đó đến sự tạo

thành enzyme, nhưng khi đó cũng cần tính đến khả năng biến đổi nhanh

chóng chỉ số đó bởi vi sinh vật. Thông thường đối với a - amylase, pH tối

ưu cho sự sinh tổng hợp (pH = 7 - 8) khác với pH tối ưu cho hoạt động của

nó (pH = 4,7 - 4,9). Các enzyme đường hóa khác của nấm mốc như

glucoamylase th. pH tối ưu cho sự sinh tổng hợp và cho hoạt động là

chung nhau (4,5 - 5,0). Độ thông khí cũng rất cần thiết cho việc sinh tổng

hợp enzyme. V. vậy ở môi trường bề mặt người ta thường thêm chất xốp

như trấu vào, c.n ở môi trường bề sâu (môi trường dịch thể) , th. người ta

thường lắc (nếu enzyme cần lắc th. việc này cực kỳ quan trọng). Độ ẩm

cũng rất quan trọng (chỉ có tác dụng ở nuôi cấy bề mặt), phụ thuộc vào

thành phần môi trường bề mặt.

Một điều cần nói thêm nữa là enzyme thường chứa ở các tế bào

sinh vật gọi là các enzyme trong tế bào (intracellular), nhưng nó cũng có

thể được các sinh vật tiết ra môi trường sống. Đó là các enzyme ngoài tế

bào (extracellular). Enzyme vi sinh vật thường chiết là enzyme ngoại bào.

2.2.2. Chiết rút enzyme

Muốn t.m hiểu toàn bộ hoạt động sống của cơ thể sinh vật, chúng

ta phải biết bản chất của những biến đổi hóa học xảy ra trong từng mô tế

bào. Điều đó chỉ thực hiện được khi chúng ta tách được các tế bào ra khỏi

các mô và chiết rút cũng như làm sạch các enzyme chứa trong chúng. Từ

các dạng enzyme tinh khiết thu được chúng ta có thể nghiên cứu sâu sắc

cơ chế tác dụng, tính đặc hiệu trong hoạt động xúc tác của chúng. Tùy

theo những đặc tính riêng biệt của từng loại enzyme mà lựa chọn phương

pháp làm sạch cho thích hợp. Trong quá tr.nh tinh chế enzyme, mặc dầu

tr.nh tự và các thủ thuật ở các bước có thể thay đổi , song vẫn có những

nguyên tắc chung.

Như chúng ta đ. biết, trong cơ thể sinh vật, enzyme có trong tế

bào chất và các cấu tử (nhân, microsome, ty thể, lysosome...) của tế bào.

Tế bào được bao bọc bằng một lớp màng. Lớp màng này ở vi khuẩn đôi

khi rất bền và dày. Người ta c.n thấy nhiều enzyme liên kết rất chặt chẽ

với các cấu tử của tế bào.

Các phân tử enzyme không có khả năng đi qua màng của tế bào và

màng của các cấu tử của tế bào. Do đó để có thể chiết rút các enzyme nội

bào, bước đầu tiên là phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào có chứa enzyme

và chuyển chúng vào dung dịch.

Có thể phá vỡ cấu trúc của các tế bào bằng các biện pháp cơ học

như nghiền với bột thủy tinh hoặc cát thạch anh, làm đồng hóa bằng thiết

bị đồng hóa (homogenizator). Thiết bị có chày thủy tinh gắn với một môtơ

quay và có thể điều chỉnh được tốc độ quay theo yêu cầu. Các tế bào giữa

chày thủy tinh và thành cối sẽ bị phá hủy. Để việc phá vỡ có hiệu quả ở

mô thực vật, trước khi nghiền người ta thường thái nhỏ mẫu để vào ngăn

đá hoặc cho trương nước (ví dụ như đối với mẫu hạt khô). C.n ở các mô

của động vật như gan hoặc thận, khi chiết enzyme người ta cần cắt bỏ các

mô liên kết.

Muốn tách được các enzyme trong các cấu tử của tế bào, người ta

c.n phải dùng các yếu tố vật l. và hóa học khác nhau như sóng siêu âm,

dùng các dung môi hữu cơ như butanol, aceton, glycerin, ethyl acetate...

và chất detergent. Các hóa chất có tác dụng tốt cho việc phá vỡ các cấu tử

của tế bào v. trong các cơ quan này thường chứa mỡ.

Sau khi đ. phá vỡ các cấu trúc của tế bào, enzyme được chiết

bằng nước cất, bằng các dung dịch đệm thích hợp hoặc các dung dịch

muối trung tính.

Có một số yếu tố ảnh hưởng đến quá tr.nh chiết rút cần lưu ..

Trước hết đó là nhiệt độ. Để tránh mất hoạt tính hoặc thậm chí vô hoạt,

cần chiết rút và tiến hành kết tủa enzyme ở nhiệt độ thấp (từ 3 đến 50C).

Các thao tác phải nhanh. Một số chất điện ly làm tăng quá tr.nh chiết rút

enzyme như NaCl, ZnCl2, CaCl2. Tác dụng của chúng c.n phụ thuộc vào

phương pháp dùng khi chiết rút. Ví dụ như nếu dùng máy nung th. cả ba

chất trên đều có tác dụng. Nếu chỉ để lắng th. chỉ NaCl có tác dụng. V.

vậy cần dùng chất điện ly thích hợp. Ví dụ khi chiết rút amylase, nếu cho

thêm NaCl 0,1 - 0,2 % vào dung dịch chiết rút th. hiệu suất chiết rút tăng

lên 30%. Người ta c.n nhận thấy, nếu thêm vào dịch chiết CaCl2 0,2% sẽ

làm cho kết tủa enzyme tốt hơn và cấu trúc của kết tủa cũng tốt hơn.

Trong quá tr.nh chiết rút enzyme ở các đối tượng động, thực vật,

có trường hợp c.n có mặt chất màu làm ảnh hưởng đến việc làm sạch hoặc

xác định hoạt độ enzyme. Trong trường hợp này người ta c.n cho thêm

vào chất khử để loại màu. Màu của hemoglobin ở hồng cầu hoặc của

chlorophyll và một số chất màu khác ở lá có thể bị loại trừ bởi hỗn hợp

ethanol, chloroform với tỷ lệ thích hợp. Hoạt độ enzyme superoxide

dismutase (SOD) - một enzyme chống ôxy hóa có thể xác định sau khi đ.

loại màu khỏi dịch chiết enzyme. Ở các mẫu từ động vật có sắc tố melanin

màu nâu. Người ta thường loại màu trên cột nhựa trao đổi ion bằng cách

cho dịch enzyme qua cột hoặc lắc. Khi qua cột, chất màu bị giữ lại và

enzyme không bị giữ. Ví dụ người ta hay dùng DEAE - cellulose

(Diethylamino ethyl - cellulose) hoặc than hoạt tính. Trong quá tr.nh này

phải chú . kiểm tra pH. Sau khi loại màu cần kiểm tra lại hoạt độ của

enzyme.

Trong dịch chiết, ngoài enzyme c.n có các protein cấu trúc, các

chất cao phân tử khác nhau như polysaccharid nucleic acid, các chất có

phân tử nhỏ như đường monose, các chất lipid, muối khoáng...Để loại

chúng phải sử dụng phối hợp nhiều biện pháp khác nhau.

Để loại bỏ muối khoáng và các loại đường... là các tạp chất có

phân tử lượng thấp, người ta thường dùng phương pháp thẩm tích

(dialysis) đối nước hay đối các dung dịch đệm lo.ng hoặc bằng cách lọc

qua gel sephadex. Cách làm thẩm tích như sau: cho dung dịch enzyme vào

túi colodion hoặc cellophane (thông thường người ta dùng cellophane tốt

hơn), sau đó đặt cả túi vào nước cất hoặc dung dịch đệm pha lo.ng (như

đệm phosphate có pH = 7, nồng độ 0,01M chẳng hạn). Màng cellophane là

màng bán thấm, có kích thước lỗ cho các chất có phân tử nhỏ xuyên và đi

qua vào các dung dịch đệm lo.ng theo định luật khuếch tán. C.n lại trong

màng là các chất protein có phân tử lớn. (H.nh 2.1)

H.nh 2.1. Thẩm tích để loại muối (NH4)2SO4 trong kết tủa protein

Để loại bỏ các protein tạp (protein cấu trúc, protein trơ) và các chất

có phân tử lượng cao khác người ta hay dùng kết hợp các phương pháp

khác nhau: phương pháp biến tích chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc

pH của môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính

hoặc các dung môi hữu cơ, các phương pháp sắc k. (sắc k. hấp phụ, sắc

k. trao đổi ion), điện di, phương pháp lọc gel.

Phương pháp biến tích chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt hoặc pH

của môi trường chỉ dùng đối với trường hợp các enzyme bền với nhiệt

hoặc bền với acid.

Thủ thuật được tiến hành như sau: dịch enzyme được giữ ở 50 -

700C hay ở pH = 5 trong một thời gian xác định. Protein bị biến tính được

loại bỏ bằng cách lọc hoặc ly tâm

2.2.3. Các phương pháp tách từng phần protein enzyme

Protein là các chất lưỡng tính,v. vậy trong các dung dịch acid và

kiềm chúng sẽ bị phân ly như sau:

kiềm

Protein - COOH protein - COO- + H+

acid

acid

Protein - NH2 protein - NH+

kiềm

Ở một chỉ số pH xác định, mỗi phân tử protein có một điện tích

tổng số nào đấy mà độ lớn của nó phụ thuộc vào số lượng các nhóm tích

điện dương và tích điện âm. Kết quả là ở chỉ số nồng độ ion hydro cố

định, các protein khác nhau trong hỗn hợp sẽ có tổng điện tích khác nhau.

Nhiều phương pháp dùng để tách các hỗn hợp protein đều dựa vào đặc

tính này. Các phân tử protein mang điện tích tổng số (dương hoặc âm)

cùng dấu đẩy nhau ra xa nên dễ tan vào dung dịch. Mỗi một protein có

một trị số pH nhất định mà ở đó tổng số điện tích âm và điện tích dương

trong phân tử bằng không. Trị số pH đó gọi là điểm đẳng điện. Ở điểm

đẳng điện, độ h.a tan của protein là thấp nhất, protein rất dễ bị kết tủa.Dựa

vào tính chất này, người ta có thể tách từng phần các protein enzyme trong

hỗn hợp...

Ở các phương pháp tách từng phần này, người ta có thể sử dụng

phương pháp kết tủa thuận nghịch bằng muối hoặc các dung môi hữu cơ,

phương pháp sắc k. cột.

Nói chung để đạt kết quả tốt, người ta thường phối hợp hai phương

pháp với nhau.

2.2.3.1. Dùng muối (NH4)2 SO4 để tách enzyme

Phương pháp kết tủa phân đoạn bằng (NH4)2 SO4 dựa trên cơ sở sự

khác nhau về khả năng kết tủa của các protein enzyme ở một nồng độ

muối (tính theo phần % nồng độ b.o h.a) xác định được dùng phổ biến để

loại bỏ bước đầu protein tạp của các dịch enzyme. Các loại muối có thể

được dùng là (NH4)2 SO4, Na2 SO4, MgSO4 ... người ta đ. nhận thấy muối

(NH4)2 SO4 là tốt nhất v. nó không làm hại mà làm ổn định (làm bền) hầu

hết các loại enzyme. Loại muối này lại rẻ và phổ biến. Độ h.a tan của nó

lại rất lớn (b.o h.a 767g/l ở 250C). Ngoài ra nồng độ (NH4)2SO4 cần thiết

để kết tủa enzyme khác nhau th. khác nhau nhiều. Ví dụ: Protease của nấm

mốc dễ bị kết tủa ở 70% của (NH4)2 SO4 b.o h.a hoàn toàn, c.n amylase

của mầm lúa bị kết tủa ở 50% độ b.o h.a của dung dịch muối này. Điều đó

nói lên tính kết tủa lựa chọn của (NH4)2SO4 cao hơn các muối khác.

Thường dùng hai dạng bột hoặc b.o h.a

- Khi dùng bột:

Người ta cho từng ít một vào dịch chiết enzyme. Cách cho cũng ảnh

hưởng lớn đến lượng kết tủa ban đầu của enzyme. Khi cho muối vào dịch

chiết cần phải có máy khuấy từ để đảm bảo sự h.a tan của muối.

- Khi dùng dung dịch b.o h.a:

Trong nhiều sách về phương pháp nghiên cứu người ta đưa ra bảng

tính số lượng muối cần thiết để pha các dung dịch có độ b.o h.a khác

nhau ở những nhiệt độ nhất định. Khái niệm về số phần trăm của độ b.o

h.a hoàn toàn đ. được đề cập đến. Như ví dụ trên đ. nói, enzyme có thể bị

kết tủa ở 50% (0,5) hoặc 70% (0,7) của độ b.o h.a hoàn toàn của (NH4)2

SO4. Khi cho dung dịch (NH4)2 SO4 vào dịch chiết enzyme th. nồng độ

(NH4)2 SO4 không tăng đột ngột.

Sau khi kết tủa xong người ta thường để lắng khoảng 2h hoặc để

qua đêm, mục đích là tạo kết tủa hoàn toàn (ở phương pháp dùng dung

môi hữu cơ th. không cần để lâu). Kết tủa được lấy ra bằng cách ly tâm

hoặc lọc qua phễu Buckner. Khi h.a tan kết tủa lại người ta thường thêm

ion Ca++ làm bền (CaCl2 hoặc Ca(COOH)2).

Ở giai đoạn loại muối, người ta dùng phương pháp thẩm tích như đ.

được tr.nh bày ở phần trước. Thời gian thẩm tích thường là 24 - 28h, nước

thay càng nhiều càng nhanh càng tốt.

Có thể loại muối bằng cách lọc qua gel sephadex G25 là dẫn suất

của dextran. Ưu thế của phương pháp này là tiến hành với thời gian ngắn

(khoảng 30 '), nên không làm mất hoạt độ enzyme. Muối có trọng lượng

phân tử bé bị giữ lại, các enzyme có trọng lượng phân tử lớn xuống trước

(xem phương pháp lọc gel 2.2.3.4.a)

Giai đoạn tiếp theo là làm đông khô thành bột trắng. Chuyển trạng

thái từ dịch nước đá sang trạng thái khí mà không qua trạng thái lỏng.

Để tiện lợi người ta đưa ra công thức cách tính lượng (NH4)2 SO4

cho vào dung dịch đ. có độ b.o h.a cho trước (S1) để đạt đến một độ b.o

h.a cần thiết (S2)

Tùy theo trạng thái (NH4)2 SO4 cho thêm vào dung dịch chiết

enzyme, mà có công thức tính toán khác nhau.

- Đối với (NH4)2 SO4 ở dạng bột

0,515 x V (S2 - S1)

x (g) =

1 - 0,272 S2

Trong đó V là thể tích dung dịch S1, S2 là độ b.o h.a cho trước và

độ b.o h.a cần đạt ví dụ S1= 0,5 và S2= 0,7 chẳng hạn.

Người ta cũng có thể dùng bản đồ toán (nomogram) để chiếu và

xác định được lượng (NH4)2 SO4 thêm vào để dung dịch enzyme đạt được

một độ b.o h.a nhất định. Hoặc có thể đối chiếu ở bảng có sẵn. Lượng

(NH4)2 SO4 đưa vào để dung dịch có độ b.o h.a nhất định có khác nhau

tùy thuộc nhiệt độ thí nghiệm.

- Đối với (NH4)2 SO4 ở dạng dung dịch b.o h.a. Thể tích (tính

theo ml) của dung dịch b.o h.a cần cho vào 100ml dung dịch có độ b.o

h.a ban đầu S1 để đạt đến một độ b.o h.a S2 cần thiết được tính theo công

thức sau:

100 (S2 - S1)

V (ml) =

1 - S2

2.2.3.2. Dùng dung môi hữu cơ

Phương pháp này được tiến hành dựa trên cơ sở: độ h.a tan của

protein phụ thuộc vào sự tương tác của các nhóm tích điện trong phân tử

protein với các phân tử nước.

Sự tương tác đó (c.n gọi là sự hydrate hóa) sẽ bị giảm xuống khi

thêm vào dung dịch enzyme các dung môi hữu cơ. Dung môi hữu cơ

thường dùng là ethanol, isopropanol, acetone hoặc hỗn hợp các loại rượu.

Ở phương pháp này cũng chú . tiến hành ở nhiệt độ thấp (từ 50C

trở xuống). Dùng dung môi hữu cơ có thể tiến hành tách phân đoạn dưới

00C và có thể đến - 200C, như vậy nó có tác dụng tốt đến độ ổn định của

protein enzyme.

Khi đ. có kết tủa, chú . lấy nhanh kết tủa ra khỏi dung môi bằng

cách dùng máy li tâm. Phương pháp này có lợi thế là không cần loại muối,

nhưng có nhược điểm là hay có màu.

2.2.3.3. Dùng nhiệt

Cũng có thể dùng nhiệt để loại bỏ các protein enzyme tạp ra khỏi

dịch chiết enzyme. Tuy vậy phương pháp này ít được dùng v. hiếm

enzyme bền với nhiệt.

2.2.3.4. Các kỹ thuật sắc k. cột

Dịch chiết enzyme đ. được loại bỏ phần lớn các protein tạp nhưng

vẫn chưa đảm bảo độ đồng nhất cần thiết. Do đó dịch chiết enzyme được

tiếp tục làm sạch bằng phương pháp sắc k. cột. Phương pháp sắc k.

(chromatography) là do hai chữ "chroma" là màu sắc và " grapho" là viết,

nghĩa là "viết bằng màu". Thuở ban đầu, người ta đ. sử dụng phương pháp

sắc k. để tách các chất màu và chỉ sau này người ta mới áp dụng cho việc

tách các chất không màu.

a. Phương pháp dùng chất rây phân tử (lọc gel - gel filtration)

Cơ sở của phương pháp lọc gel là dựa vào sự khác nhau về kích

thước h.nh dạng và phân tử lượng của enzyme có trong hỗn hợp để tách

chúng ra.

Để đảm bảo cho việc tách enzyme được tốt, chất rây phân tử phải là

chất trơ, không phản ứng với protein enzyme. Chất này cũng không h.a

tan và tương đối bền với các yếu tố về cơ học cũng như sinh học. Ngoài ra

chất được sử dụng cho mục đích lọc phân tử phải là chất không có tính

đàn hồi (không co) và phải là chất ưa nước (hydrophyl).

Gel sephadex là chất thoả m.n các yếu tố trên. Sephadex là chế

phẩm dextran do các loài vi sinh vật khác nhau là Leuconostoc tạo ra khi

chúng được nuôi cấy trên môi trường chứa saccharose. Trọng lượng phân

tử của dextran có thể đạt tới hàng triệu và lớn hơn. Phân tử dextran bao

gồm các chuỗi do các gốc glucose tạo thành các liên kết glucsid 1,6.

Sephadex nhận từ dextran bằng cách xử l. hóa học (do tác dụng của

epichlohidrin) để tạo ra các lưới phân nhánh có liên kết ngang gọi là "sàng

phân tử" và chất này trở thành không tan trong nước. Số liên kết ngang tạo

ra càng nhiều, kích thước của lỗ sàng phân tử càng nhỏ.

Phương pháp lọc trên sephadex được tiến hành như sau: cho

sephadex vào cột thủy tinh dài và cân bằng bằng dung dịch đệm có pH

nhất định. Sau đó cho dung dịch enzyme lên cột. Khi lọc và chiết bằng

dung môi thích hợp, các phân tử có trọng lượng phân tử nhỏ (ở đây là các

muối) sẽ khuyếch tán chậm chạp qua các lỗ nhỏ của các hạt Sephadex bị

trương phồng, c.n chất có trọng lượng phân tử lớn hơn (ở trường hợp này

là protein enzyme ) không có khả năng đi vào mà lách nhanh qua các hạt

sephadex và sẽ rơi xuống trước, sẽ được chiết nhanh ra khỏi cột (H.nh 2.2.

và h.nh 2.3.). V. vậy ta có thể tách được chất có trọng lượng phân tử cao

hơn ra khỏi chất có phân tử lượng nhỏ. H.ng Sephadex (Pharmacia) của

Thuỵ Điển đ. tung ra thị trường các loại sephadex có kích thước khác

nhau có k. hiệu từ G10 đến G200. Số k. hiệu nhằm chỉ ra mức độ nhận

(hút) nước của chúng. Ví dụ G10 để chỉ khi trương phồng th. 1g gel khô

nhận 1ml nước (1ml/g)

H.nh 2.2. Hoạt động của lọc phân tử sephadex

Các sephadex có k. hiệu khác nhau từ G10 đến G200 phục vụ trong

việc lọc phân tử cho phép các chất có trọng lượng phân tử khác nhau lọt

vào ở các ngưỡng sau đây:

Các loại sephadex Trọng lượng phân tử

G. 10 0 - 700

G. 15 0 - 1.500

G. 25 hạt tinh (F)

hạt thô (C)

100 - 5000

G. 50 hạt tinh (F)

hạt thô (C)

1500 - 30.000

G. 75 3.000 - 70.000

G. 100 4.000 - 150.000

G. 150 5.000 - 400.000

G. 200 5.000 - 800.000

34

muäúi

protein

Các gel lọc phân tử được sản xuất trong 4 cỡ hạt cùng trong một

v.ng lọc phân tử: hạt thô (coarse), hạt trung b.nh (medium), hạt mịn

(fine), hạt siêu mịn, rất mịn (superfine).

H.nh 2.3. Tách các phân tử theo kích thước bằng sắc k. lọc gel

Sự chênh lệch nhiều v. phân tử lượng của các enzyme (12700 -

1.000.000) cho phép nghỉ rằng để tách và làm sạch enzyme, phương pháp

lọc gel sephadex là phương pháp có nhiều triển vọng. Nơi có ít liên kết

ngang tách chất có trọng lượng phân tử lớn và ngược lại. Người ta c.n sử

dụng sephadex để loại muối thay cho quá tr.nh thẩm tích.

Cùng nhóm chất rây phân tử có nguồn gốc polysaccharid, là chế

phẩm dextran như sephadex (pharmacia) c.n có Molselect (Reanal) - là

sản phẩm của Hungary được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu.

Có thể dùng để làm cô đặc các chất có trọng lượng phân tử lớn như

protein, peptid, loại muối khỏi protein enzyme (dùng nhanh hơn so với

thẩm tích), lọc gel tách theo trọng lượng phân tử (như protein huyết thanh)

hoặc tách các sản phẩm protein được h.nh thành dưới tác dụng của

enzyme phân cắt (như g - G - globulin bị cắt bởi papain).

Caïc phán tæí låïn khäng thãø âi

vaìo caïc haût Sephadex

Caïc phán tæí nhoí âi vaìo bãn

trong caïc haût Sephadex

Haût Sephadex

Các Molselect cũng có k. hiệu từ G10 đến G200 phục vụ trong việc

lọc phân tử cho phép các chất có trọng lượng phân tử khác nhau lọt vào ở

các ngưỡng sau đây:

Các loại Molselect Trọng lượng phân tử

G - 10 <700

G - 15 <1500

G - 25 100 - 5000

G - 50 500 - 10.000

G - 75 1.000 - 50.000

G - 100 1.000 - 100.000

G - 200 1.000 - 200.000

Ngoài nhóm chất rây phân tử là chế phẩm dextran c.n có nhóm chất

rây phân tử là chế phẩm gel acrylamide bao gồm Biogel (Bio - Rad) và

Acrilex (Reanal). Acrilex gel là loại copolime, sản phẩm của Hungary

được tạo ra từ acrylamide và N, N' - methylen – bis - acrylamide. Các

acrilex gel có k. hiệu từ P - 2 đến P -300 dùng để tách các chất có trọng

lượng phân tử trong ngưỡng từ 100 đến 300.000. Có thể sử dụng ở vùng

pH từ 2 – 11. Chất thứ ba là agarose loại sulphate. Hay phổ biến là loại

sepharose (pharmacia). Người ta thường dùng chất này để tách các phân tử

có trọng lượng lớn hơn 106.

Tóm lại bằng phương pháp lọc phân tử người ta có thể tách các chất

có trọng lượng phân tử khác nhau có trong hỗn hợp (như polymer,

polysaccharid, nucleic acid , protein) ra. Người ta có thể dùng kỹ thuật này

để loại muối thay cho quá tr.nh thẩm tích. Và hơn thế nữa, trong quá tr.nh

tinh chế protein enzyme, chúng c.n được sử dụng để cô đặc dung dịch

protein enzyme.Việc sắc k., lọc phân tử protein hoặc chiết xuất protein

thường thu được dung dịch lo.ng, nếu không cô đặc dung dịch để cho phù

hợp đối với các nghiên cứu tiếp theo th. không dùng được. Molselect G -

25 rất thích hợp cho việc cô đặc các dung dịch lo.ng của các chất có trọng

lượng phân tử lớn như protein, peptid. Bằng cách trộn với dung dịch

protein lo.ng, Moltelect sẽ nhận nước và chất có trọng lượng phân tử nhỏ,

như vậy dung dịch protein được cô đặc mà không có sự thay đổi về pH và lực

ion của nó.

b. Phương pháp sắc k. trao đổi ion

Phương pháp sắc k. trao đổi ion dựa vào sự khác nhau về điện tích

tổng số của các protein enzyme. Hay nói cách khác, phương pháp này

được dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protein được tan trong

nước hoặc dung dịch đệm lo.ng và các tác nhân trao đổi ion. Tác nhân

(hay nguyên liệu) trao đổi ion có thể là chất nhựa có tích nhóm sinh ion

hoặc là chất ionit. Đây là những chất giá trơ, không tan trong nước, có bản

chất là cellulose hoặc chất gel dextran có lưới phân nhánh (Sephadex,

Molselect) hoặc là chất nhựa polystirol. Chất giá thể này thường kết hợp

với các nhóm ion hóa. Các chất trao đổi ion có chất giá là cellulose,

sephadex, molselect thông thường được dùng để tách protein enzyme, c.n

các chất trao đổi ion có chất giá là polystirol (ví dụ như Dowex,

Amberlite) chỉ dùng để tách các peptid có trọng lượng phân tử nhỏ hơn.

* Các chất trao đổi ion có chất giá cellulose

Cationit CM - cellulose (carboxylmetyl - cellulose) - là một dẫn xuất

este của cellulose. Cellulose - O - CH2 – COOH. Khi phân li cho ra COO-.

Đây là chất trao đổi cation. Trên những cationit, th. các protein kiềm có

thừa những nhóm amin và những nhóm kiềm khác được hấp phụ. Sự hấp

phụ trên các cationit được tiến hành với những dung dịch lo.ng ở pH 1,5 -

6,5. (Các protein kiềm có chứa các amino acid diamino - mono carboxylic

như lys, Arg, His)

Anionit DEAE - cellulose (diethylamino - ethyl - cellulose) là dẫn

xuất este của cellulose.) C2H5

Cellulose - O - CH2 - CH2 - N

C2H5

Trong H2O nó được phân ly:

Cellulose - O - C2H4 - N - (C2H5)2 + H2O

C2H5

Cellulose - O - C2H4 - N+ + OH -

H C2H5

Đây là chất trao đổi anion

Các anionit được áp dụng để phân tích các protein acid có thừa

những nhóm carboxyl tự do. Sự hấp phụ protein trên những ionit như vậy

được tiến hành với những dung dịch đệm có lực ion thấp (0,005 - 0,1M) ở

pH 7,5 - 8,5, (các protein acid có chứa các amino acid monoamin).

Trong hỗn hợp chất ionit với dung dịch đệm có độ pH tương ứng,

các chất ionit đ. nói ở trên trở nên tích điện,. V. vậy trên bề mặt lớp chất

giá sẽ h.nh thành một lớp điện tích có dấu phụ thuộc vào kiểu nhóm chức

hóa học của nó. Nếu thêm protein - enzyme vào dung dịch đệm th. các

phân tử enzyme mang điện tích sẽ bị các nhóm tích điện trái dấu của chất

trao đổi ion kéo lại. Khi dùng một dung dịch đệm để phản hấp phụ có pH

khác hoặc khi thêm một loại ion khác có lực ion lớn hơn th. phân tử

protein enzyme sẽ bị đẩy ra khỏi chất trao đổi ion. Khi tiến hành phản hấp

phụ, thường người ta thêm vào các ion Na+ và Cl- trong NaCl có nồng độ

tăng dần theo bậc thang hay theo gradient.

Các phân tử protein enzyme nào có điện tích tổng số nhỏ th. sẽ bị

đẩy ra trước do lực liên kết với chất trao đổi ion yếu. C.n những protein

enzyme nào có liên kết với ionit lớn hơn th. sẽ bị đẩy ra bằng một lực ion

của muối lớn hơn. Như vậy, bằng cách này, chúng ta có thể tách được

từng phần các loại protein enzyme. Việc tách từng phần có lựa chọn tốt

nhất là khi tăng dần nồng độ các ion thay thế. Nhờ nồng độ ion của muối

tăng dần (gradient) người ta có thể rút ra từ cột các loại protein enzyme

khác nhau. Có thể thu nhận dịch chiết enzyme protein sau khi qua cột

bằng máy thu phân đoạn tự động. Theo thứ tự từng phần dịch thu được,

người ta tiến hành định lượng protein theo các phương pháp Lowry hay

phương pháp đo quang phổ và xác định hoạt độ của enzyme. Ngoài việc

dùng muối NaCl cho các ion Na+ và Cl-, người ta có thể dùng các loại

muối khác như KCl, Na3PO4.

Nếu chất giá là sephadex th. chúng ta có chất trao đổi ion sephadex.

Đó là các loại DEAE - sephadex và CM - sephadex. Ưu điểm của loại này

là vừa tách được protein enzyme về kích thước và về điện tích tổng số của

các protein enzyme. Trường hợp CM - sephadex trên chất giá sephadex có

gắn nhóm COO-

- O - CH2 - COOH

phân ly

COO - (mang điện tích âm)

Đây là chất trao đổi cation.

c. Phương pháp dùng chất hấp phụ

Nhiều protein và enzyme gắn một cách chọn lọc vào các chất hấp

phụ nhất định như silicagel, bentonite, g - aluminium hydroxid,

hydroxyapatite và nhờ vậy, chúng có thể được làm sạch với hiệu suất cao.

Phương pháp hấp phụ chọn lọc - hấp phụ trong thể tích (thêm chất

hấp phụ trực tiếp vào dịch enzyme) hoặc trên cột (sắc k. hấp phụ) được

dùng phổ biến trong việc tách và làm sạch enzyme. Chất hấp phụ chủ yếu

thường được dùng là hydroxyapatite cho hiệu quả phân tách đặc biệt cao.

Hấp phụ chọn lọc enzyme có thể thực hiện bằng một trong hai cách : chất

hấp phụ hoặc hấp phụ protein tạp hoặc hấp phụ enzyme. Quá tr.nh hấp

phụ thường được tiến hành ở 00C. Bằng cách thay đổi độ pH hoặc lực ion

của dung môi thích hợp, các enzyme được hấp phụ có thể được chiết khỏi

chất hấp phụ.

d. Phương pháp dùng chất hấp phụ đặc hiệu sinh học hay là phương

pháp sắc k. ái lực (affinity chromatography)

Cơ sở của phương pháp này là người ta gắn những phân tử (chất)

vào chất mang (chất giá) rắn bằng liên kết cộng hóa trị mà protein enzyme

cần tách sẽ tương tác đặc hiệu với nó. Những chất đó có thể là cơ chất

(Substrate) hoặc chất ức chế (inhibitor) cạnh tranh. Hay nói cách khác

dùng chất chỉ có khả năng liên kết đặc hiệu với một enzyme hoặc protein

mà người ta nghiên cứu.

Chất mang thể rắn có thể là bất kỳ một loại nào phục vụ cho lọc

gel như sephadex, nhưng người ta hay sử dụng nhất là gel sepharose.

Ở trên cột chứa cơ chất cố định ở pH và lực ion phù hợp, chỉ có

enzyme nào có khả năng chuyển hóa cơ chất mới gắn vào, các protein

khác th. chảy xuống cột. Bằng cách thay đổi pH và lực ion phù hợp hoặc

có thể bằng cách thêm cơ chất đ. được h.a tan vào th. có thể tách được

enzyme khỏi cột ở trạng thái sạch.

2.2.4. Kết tinh protein enzyme

Đây là phương pháp đặc hiệu tốt nhất để tách từng phần protein

enzyme ở giai đoạn tinh chế cuối cùng.

Khi protein enzyme đ. được làm tinh khiết hoàn toàn, trong những

trường hợp riêng biệt, người ta có thể tiến hành kết tinh chúng. Một điều

cần chú . là protein enzyme ở trạng thái tinh thể không thể được coi là

bằng chứng về sự tinh khiết. Các tinh thể protein enzyme kết tinh lần đầu

đôi khi có độ sạch không vượt quá 50% và có thể chứa các protein enzyme

khác. Người ta thường tiến hành kết tinh protein enzyme trong dung dịch

(NH4)2SO4. Quá tr.nh kết tinh có thể tiến hành từ từ kéo dài vài ngày thậm

chí hàng tuần nếu muốn nhận được các tinh thể tốt. Thông thường là thêm

muối (NH4)2SO4 vào dung dịch protein enzyme khá đậm đặc cho đến khi

làm vẫn đục nhẹ nhàng dung dịch. Sau đó đặt dung dịch vào một nơi, đồng

thời tăng rất từ từ nồng độ muối trong dung dịch. Có thể tiến hành tăng

nồng độ muối theo nhiều cách, thêm dung dịch muối đậm đặc hơn vào

dung dịch protein enzyme theo từng giọt, thêm muối qua màng bán thấm

hoặc có thể cho bay hơi chậm chạp dung dịch protein enzyme. Trong quá

tr.nh kết tinh có thể thay đổi chỉ số pH hoặc nhiệt độ. Để kết tinh protein

enzyme được dễ dàng, ở những giai đoạn trước đó, người ta thường tách

từng phần các protein enzyme bằng các dung môi hữu cơ. Điều này có lẽ

liên quan đến việc các chất có bản chất lipid bị loại ra khỏi dung dịch

protein enzyme tạo điều kiện tốt cho quá tr.nh kết tinh.

2.2.5. Đánh giá tính đồng thể của protein enzyme

Khi đ. nhận được một protein enzyme ở trạng thái kết tinh, người ta

phải thử lại mức độ tinh khiết hay tính đồng thể của nó. Độ đồng thể của

chế phẩm protein enzyme phải được kiểm tra bằng một số phương pháp

dựa trên những nguyên l. khác nhau. Trong một số trường hợp protein

enzyme được coi là đồng thể khi ly tâm, nhưng lại có thể phân chia thành

một số isoenzyme bằng phương pháp điện di trên gel. Chính v. vậy, nếu

dùng nhiều loại phương pháp khác nhau để kiểm tra độ sạch của protein

mà kết quả đều cho là đồng thể th. protein đó có thể được công nhận là

tinh khiết. Những phương pháp để kiểm tra tính đồng thể hay dùng là xây

dựng đồ thị về độ h.a tan, điện di và siêu ly tâm.

- Phương pháp kiểm tra tính đồng thể (hoặc c.n gọi là tính đồng

nhất) của protein đơn giản và nhạy nhất là xây dựng đường biểu diễn về

độ h.a tan.

Cách làm như sau: Trong hàng loạt mẫu dùng một thể tích không đổi

một loại dung môi (nước hoặc dung dịch muối) lắc với những số lượng

enzyme khác nhau. Sau đó lọc và xác định số protein trong dịch lọc. Cuối

cùng xây dựng đường đồ thị.

Trong những loại mẫu đầu, tất cả các protein thêm vào bị h.a tan và

số lượng protein thêm vào bằng số lượng protein có trong dịch lọc hay

dịch ly tâm. Kết quả nhận được biểu diễn là một đường thẳng. Sau đó

dung dịch đạt được b.o h.a. Nếu protein đem h.a tan là tinh khiết nghĩa là

đồng nhất th. khi thêm protein trong dịch lọc sẽ không tăng lên và đường

biểu diễn có một điểm uốn.

Nếu trong mẫu có một protein thứ hai th. sau khi đạt được độ b.o

h.a đối với protein ít h.a tan hơn, loại protein thứ hai c.n có thể h.a tan

được nữa.

H.nh 2.4. Đường biểu diễn độ h.a tan protein

Kết quả là có một điểm b.o h.a thứ hai và đường biểu diễn có hai

điểm uốn. Nếu dịch chiết (hỗn hợp) có nhiều protein enzyme th. sẽ có

nhiều điểm uốn. Phương pháp này được Northrop và Kunitz sử dụng rất

có kết quả. Nay vẫn c.n ứng dụng nhiều.

- Phương pháp thứ hai để xác định độ đồng thể của protein enzyme

là phương pháp điện di. Phương pháp điện di là ứng dụng tính chất lưỡng

tính của protein, dựa trên cơ sở dịch chuyển của các tiểu phần chế phẩm

protein enzyme mang điện trong điện trường. Đem chế phẩm protein

enzyme điện di ở pH và lực ion nhất định. Nếu trên điện di đồ có một đỉnh

th. chứng tỏ protein enzyme đó là đơn thể. Nếu có hai đỉnh chứng tỏ có

hai protein enzyme trong chế phẩm đó.

- Phương pháp siêu ly tâm:

Đây cũng là phương pháp rất quan trọng để xác định tính đồng thể

của protein enzyme. Phương pháp được thực hiện như sau:

Dùng lực ly tâm rất lớn bằng cách tăng số v.ng quay ly tâm lên

hàng ngh.n, hàng vạn v.ng trong một phút. Với tốc độ ly tâm rất lớn,

người ta có thể tách ra được các phân tử enzyme có trọng lượng phân tử

khác nhau.

Số lượng protein cho thêm

Số lượng protein trong dịch lọc

A

B

A: Protein đơn thể

B: Hỗn hợp 2 protein

Tốc độ kết tủa của protein enzyme trong máy siêu ly tâm được xác

định bằng trọng lượng phân tử của nó. Khi dừng quay th. các phân tử

protein lại khuyếch tán vào dung dịch. Bởi vậy, cần phải quan sát tốc độ

lắng trong quá tr.nh siêu ly tâm. Chính v. vậy, trong cốc siêu ly tâm, người

ta gắn một thiết bị quang học đặc biệt, vẽ các đường ánh sáng của kết quả

phân tích lên một màn. Nếu trong dung dịch có một loai protein enzyme

(có một trọng lượng phân tử) th. trên màn sáng sẽ cho đường đồ thị có một

đỉnh. Nếu làm việc với hai protein enzyme th. sẽ có hai đỉnh v.v...

2.3. Hoạt độ enzyme

2.3.1. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme

Khác với trong hóa học phân tích b.nh thường, trong enzyme học,

người ta không định lượng enzyme một cách trực tiếp mà thường xác định

gián tiếp thông qua xác định độ hoạt động (c.n gọi là hoạt độ) của

enzyme. Trong phán ứng có enzyme xúc tác, sự hoạt động của enzyme

được biểu hiện bằng cách làm thay đổi các tính chất vật l., hóa l. cũng

như tính chất hóa học của hỗn hợp phản ứng. Theo d.i những biến đổi đó

có thể biết được chính xác mức độ hoạt động của enzyme thông qua xác

định cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng.

Để xác định hoạt độ của enzyme ở các dịch chiết hoặc ở chế phẩm

người ta thường dùng các phương pháp vật l. hoặc hóa học. Các phương

pháp, so màu, đo khí, đo độ phân cực, đo độ nhớt, chuẩn độ... được dùng

phổ biến trong nghiên cứu định lượng các phản ứng enzyme.

Có thể chia ra ba nhóm phương pháp sau:

1. Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành

trong một thời gian nhất định ứng với một nồng độ enzyme xác định.

2. Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định

của cơ chất hay sản phẩm với một nồng độ enzyme nhất định.

3. Chọn nồng độ enzyme như thế nào để trong một thời gian nhất

định thu được sự biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm.

2.3.2. Đơn vị hoạt độ enzyme

Hội nghị quốc tế về hóa sinh enzyme đ. đưa ra khái niệm đơn vị

enzyme quốc tế (hoặc đơn vị enzyme tiêu chuẩn) vào năm 1961.

Đơn vị hoạt độ enzyme (U) là lượng enzyme có khả năng xúc tác

làm chuyển hóa 1 micromole (1mmol) cơ chất sau một phút ở điều kiện

tiêu chuẩn.

1 U = 1mmol cơ chất (10-6 mol)/ phút.

Từ năm 1972 người ta lại đưa thêm khái niệm Katal (Kat)

- Katal (Kat) là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa 1

mol cơ chất sau một giây ở điều kiện tiêu chuẩn

1 Kat = 6.107 U

Và 1 U

60

= 1 microkatal

Đối với chế phẩm enzyme, ngoài việc xác định mức độ hoạt động

c.n cần phải đánh giá độ sạch của nó. Đại lượng đặc trưng cho độ sạch

của chế phẩm enzyme là hoạt độ riêng.

- Hoạt độ riêng của một chế phẩm enzyme là số đơn vị enzyme/ 1mg

protein (U/mg) cũng có thể 1g chế phẩm hoặc 1 ml dung dịch enzyme.

Thông thường hàm lượng protein được xác định bằng phương pháp

Lowry. Khi đ. biết khối lượng phân tử của enzyme th. có thể tính hoạt độ

phân tử.

- Hoạt độ phân tử là số phân tử cơ chất được chuyển hóa bởi một

phân tử enzyme trong một đơn vị thời gian.

Hoạt độ phân tử lớn (c.n gọi là con số chuyển hóa hoặc con số

v.ng: turnover number) có nghĩa là phản ứng được xúc tác xảy ra rất

nhanh. Như vậy, hoạt độ phân tử chính là khả năng xúc tác: hoạt độ phân

tử càng cao th. khả năng xúc tác càng lớn. Ví dụ người ta đ. xác định

được hoạt độ phân tử cao của một số enzyme tinh khiết như catalase (5,6 x

106) acetyl - cholinesterase (3,0 x 106), b-amylase (1,2 x 106).

Cũng cần chú . rằng trong một số trường hợp định nghĩa về đơn vị

hoạt độ enzyme ở trên không thể áp dụng được. Nếu cần thiết chúng ta sẽ

đưa ra các điều kiện thí nghiệm tương đối hoặc định nghĩa của các đơn vị

khác. Ở nơi có nhiều hơn một mối liên kết của phân tử cơ chất bị tấn công

th. một đơn vị hoạt độ enzyme là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm

chuyển hóa một micro - đương lượng của nhóm liên quan sau 1 phút ở

điều kiện xác định. Ở nơi có hai phân tử giống nhau phản ứng với nhau th.

1 đơn vị hoạt độ là lượng enzyme xúc tác cho sự chuyển hóa của 2 mmol

cơ chất sau 1 phút.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Nguyễn Hữu Chấn, 1983. Enzyme và xúc tác Sinh học. Nxb Y học, Hà Nội.

2. Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng, 2000. Hóa sinh học. Nxb Giáo dục, Hà Nội.

3. Đỗ Ngọc Liên, Phạm Thị Trân Châu, 1972. Enzyme I, II. Đại học Tổng

hợp, Hà Nội.

4. Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Đ.nh Huyên, 1998. Giáo tr.nh sinh hóa

hiện đại. Nxb Giáo dục, Hà Nội.

5. Nguyễn Xuân Thắng, Đào Kim Chi, Phạm Quang Tùng, Nguyễn Văn

Đồng, 2004. Hóa sinh học. Nxb Y học, Hà Nội.

6. Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng, 1982.

Enzyme vi sinh vật. Nxb KH&KT, Hà Nội.

7. Lê Ngọc Tú (chủ biên), Lê Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thăng

Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lưu Duẫn, Lê Do.n Diên, 2000. Hóa sinh

Công nghiệp, Nxb KH&KT, Hà Nội.

Tài liệu tiếng nước ngoài

1. Bermeyer H. U, Bermeyer J. and Grasel M. (editors). 1983. Methods of

enzymatic analysis. Vol II. Verlag chemie Weinheim.

2. Lehringer A. L., 2004. Principle of Biochemistry, 4th Edition. W.H

Freeman, 2004.

3. Pelmont J., 1993. Enzymes. Presses universitaires de grenobe.

4. Stryer L., 1981. Biochemistry. W.H.Freeman and company. San

Francisco.

5. Biochemical information, 1973. Boehringer Mannheim GmbH.

Biochemica.